Introduction

La masse est une caractéristique fondamentale d’un composé. Elle est reliée à sa composition, son inertie, son énergie. Pour la mesurer, une balance peut être utilisée dont le principe de mesure est basé sur la force de gravitation terrestre. Cependant une masse inférieure à 0,1 µg (1*1016 Da) ne peut être détectée et mesurée avec précision. A l’opposé, les spectromètres de masse, en utilisant un champ électrique et/ou magnétique pour séparer en phase gazeuse des composés préalablement ionisés selon leur rapport masse-sur-charge (m/z), permettent de mesurer avec précision des masses de l’ordre de 0,1 zg (10 Da). Mais la spectrométrie de masse conventionnelle se trouve limitée quant à la mesure de masses molaires supérieures à 1*106 Da (1 ag). En effet, au-delà de cette limite, les spectres de masse deviennent insolubles à cause de distributions d’états de charge complexes et d’une plus grande hétérogénéité de l’échantillon notamment due à une plus grande polydispersité originelle en masse. Ainsi un intervalle de masse reste non exploré se superposant dans une large mesure au domaine de masse du nanomonde et qui constitue une « niche » analytique à laquelle le développement de la spectrométrie de masse à détection de charge se propose de répondre (Figure 1).


 

Figure 1. Le domaine de masse du « nanomonde » et le positionnement de la spectrométrie de masse à détection de charge.

La spectrométrie de masse à détection de charge (CDMS) est une technique instrumentale de mesure de la masse dans une approche « particule unique ». Elle permet la mesure simultanée et indépendante de la charge et du rapport masse-sur-charge de chaque ion constitutif de l’échantillon et transféré en phase gazeuse jusqu’au détecteur. La masse de ces ions peut ainsi être déterminée de manière individuelle et la distribution en masse représentative de la dispersion de l’échantillon peut être construite ion par ion grâce à un taux de comptage élevé. Ci-après est montré comment ce système de détection de charge a permis de déterminer les distributions en masse d’échantillons de nature chimique et de morphologie très variées. Cet instrument propose aussi le couplage du système de détection de charge à un laser autorisant l’étude, au niveau de la particule unique, des interactions lumière-matière dans une gamme de masse encore inexplorée.

Aspects expérimentaux

Le dispositif expérimental est schématisé en Figure 2. L’échantillon à analyser est injecté dans une source electrospray (ESI) sous la forme d’une solution ou d’une suspension à une concentration de l’ordre du nM ou 1014 particules/L. Des mélanges de solvants contenant de l’eau et un solvant organique volatil (MeOH, ACN, etc) sont couramment utilisés. La solution ou la suspension entre dans la source ESI par l’intermédiaire d’un capillaire métallique sur lequel est appliquée une différence de potentiel de 2 à 3 kV typiquement. Un spray de gouttelettes multichargées se forme, et, par l’action combinée d’un flux d’azote chauffé à 200°C et le transfert sous vide des espèces chargées via un capillaire en verre, un flux d’ions en phase gazeuse est ainsi généré, représentatif des espèces chimiques initialement en solution. Celui-ci est guidé et les ions accélérés  jusqu’à la chambre de détection qui contient deux détecteurs de charge identiques. Chaque détecteur de charge est constitué d’un tube conducteur colinéaire au faisceau d’ions et relié à un transistor à effet de champ (JFET) qui détecte le courant induit sur le tube par le passage d’un ion. Ce courant est converti en tension, puis le signal est amplifié, filtré et mis en forme par un système d’amplification dédié. Les signaux sont enregistrés individuellement grâce à une carte oscilloscope puis transférés à un programme informatique qui procède à l’analyse des données brutes d’amplitude et de temps-de-vol.  Le temps-de-vol de l’ion (sa vitesse), est, connaissant l’énergie apportée à celui-ci (la tension d’accélération), proportionnel à son rapport masse-sur-charge. Ainsi la masse des ions peut donc être déterminée individuellement et la distribution en masse de l’échantillon reconstruite ion par ion grâce à un taux de comptage élevé. L’instrument fait l’objet d’une double calibration. La première est une calibration interne de l’électronique de détection de charge obtenue via une capacité test qui permet d’envoyer un nombre connue de charges vers le système de détection et d’amplification. Enfin une calibration externe est mise en œuvre pour ici s’affranchir de l’incertitude quant à la tension d’accélération effectivement « vue » par les ions, celle-ci pouvant éventuellement varier en fonction du rapport masse-sur-charge des ions. Cette calibration externe est faite avec des standards analytiques nanoparticulaires labellisés NIST, à savoir des billes de polystyrène de 70, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 et 500 nm. L’approximation sphérique et la densité du polystyrène massif (1.055) sont alors utilisées pour calculer les masses correspondantes. La précision sur la mesure de la masse est finalement de 10 à 15 %.

 

Figure 2. Schéma de l'instrument et du principe de la détection de charge.

Un second détecteur de charge peut être utilisé comme un piège à ion grâce à des miroirs électrostatiques situés de part et d’autre du tube. Les ions piégés peuvent être sélectionnés par l’intermédiaire d’un déflecteur électrique placé entre les deux détecteurs. Le déflecteur est synchronisé sur deux discriminateurs en charge et en temps-de vol. Une fois piégé, l’ion peut osciller plus de 50 ms si les tensions sur les miroirs électrostatiques sont choisies de façon adéquates en fonction de l’énergie cinétique de l’ion. Durant le temps de piégeage, un laser continu à CO2 (10,6 µm ; 25 W) est utilisé de façon synchronisé pour irradier l’ion à travers une fenêtre en séléniure de zinc.

Distributions en masse de nano-objets

En mode simple-passage, les distributions en masse d’un polymère synthétique (le poly(oxyde d’éthylène)) disponible commercialement à des masses nominales de 1 à 7 MDa ont d’abords été déterminées. Les masses moyennes ainsi que les indices de polydispersité obtenus sont en bon accord avec les données du fournisseur et la littérature lorsque celles-ci étaient disponibles. Dans cette gamme de masse ont été également étudiées des biomacromolécules telles que l’ADN montrant des distributions en masse étroites et la présence éventuelle de dimères.

 

Figure 3. Au centre, diagramme 3D du nuage de points de la charge en fonction de la masse obtenu pour des billes de polystyrène de 100 nm et les distributions (projections) respectives. En périphérie, distributions de masse obtenues pour différents types de nano-objets tels que des agrégats biomoléculaires fibrillaires, des nanosphères organiques avec adsorbées en surface des nanoparticules inorganiques d’oxyde de fer (nanohybrides 1), ou des  « nanofleurs » d’or (nanohybrides 2).

Une seconde étude comparative a porté sur des micelles de copolymères à blocs amphiphiles auto-assemblés. Ces nano-objets organiques se caractérisent par un diamètre de cœur hydrophobe allant de 78 à 143 nm d’après des mesures en microscopie électronique à transmission. Les premiers résultats remarquables furent que i) les micelles préservent leur intégrité structurelle après le processus d’ionisation ainsi que le transfert en phase gazeuse et ii) il est possible d’étendre la gamme d’étude de la spectrométrie de masse de quelques megadalton jusqu’au gigadalton. Des distributions en masse ont été obtenues pour chaque échantillon de micelles d’où ont été extraits les masses molaires moyennes en poids (Mw) et en nombre (Mn) ainsi que les indices de polydispersité (Mw/Mn) respectifs selon les définitions IUPAC en vigueur. D’autres systèmes de nature chimique et de forme variées, d’architecture complexe, de composition hybride ou composite, ont été étudiés mettant en évidence la souplesse et la polyvalence du spectromètre.  La Figure 3 récence quelques résultats marquants obtenus avec notre instrument.

Piégeage et photo-dissociation induite par laser de particule unique

Un ion unique préalablement sélectionné en masse et en charge peut être piégé dans le second détecteur de charge pendant plusieurs dizaines de millisecondes ce qui correspond à plusieurs centaines d’oscillations générant un signal périodique (Figure 4 a)). Le premier bénéfice du piégeage est d’ordre analytique puisque la charge et le temps-de-vol de l’ion peuvent être remesurés autant de fois que l’ion oscille. La précision sur la mesure de la charge peut ainsi atteindre 0,5 % pour un ion portant 1000 e et la résolution en masse est ainsi améliorée d’un facteur 20 à 30.

 

Figure 4. a) Signal d’un ion unique d’ADN (lambdaphage, 30 MDa) piégé. En rouge, l’évolution de la charge de l’ion moyennée sur cinq oscillations. b) Transformée de Fourier du signal issu de a) montrant une fréquence d’oscillation fondamentale de l’ion à 13,8 kHz et une première harmonique à 27,6 kHz. c) Signal d’un ion unique d’ADN (lambdaphage, 30 MDa) piégé et sous irradiation du laser à CO2 à la puissance de 14,6 W/cm2. L’insert montre un agrandissement du signal entre 8 et 10 ms.

Par ailleurs, l’ion piégé peut être irradié par le faisceau d’un laser à CO2 qui produit des photons infrarouges de basse énergie. L’ion est ainsi chauffé par l’absorption multiple de photons infrarouges pouvant conduire à sa dissociation. L’effet laser est suivi in situ, la photodissociation se produisant dans le détecteur de charge. Lorsque l’ion est irradié, des changements drastiques sont observés au niveau du temps de piégeage et du profil du signal. En effet, après un temps d’induction, un déclin de la charge est généralement observé (Figure 4 c)). Les profils de ces déclins varient d’un ion à un autre et aussi en fonction de la puissance laser. De ces mesures de déclin de charge à l’échelle de l’ion unique peuvent être déterminés des constantes de dissociation et des énergies d’activation de dissociation unimoléculaire.

 

Conclusion et perspectives

Le développement au sein de l’Institut Lumière Matière d’un instrument de spectrométrie de masse à détection de charge est unique en France et en Europe. Ce développement instrumental de pointe a un caractère fédérateur en mobilisant toutes les compétences scientifiques et techniques du laboratoire pour répondre à des défis mécanique et électronique. En particulier la mise au point d’amplificateurs électroniques équipés de filtres ayant des limites de détection inférieures à tout montage commercial actuel et le développement d’outils informatiques conciliant acquisition, automatisation et traitement du signal constituent deux exemples marquants. Le caractère original et innovant, souple et polyvalent, et relativement simple de conception et d’utilisation offrent et offriront des retombées scientifiques que socio-économiques

Ce dispositif instrumental développé à Lyon représente une nouvelle méthodologie analytique pour la caractérisation en masse de nano-objets qui s’inscrit dans le besoin crucial de développement de nouveaux outils de nanométrologie. Cette spectrométrie de masse dite « megadalton » pourrait constituer une rupture technologique vis-à-vis des techniques usuelles de caractérisation en taille telles que la microscopie électronique et la diffusion de la lumière, entre autres.

Le couplage avec une source laser a permis de repousser les limites de l’IRMPD (Infrared Multiphoton Photodissociation) en termes de masse. L’analyse à l’échelle de la particule unique constitue en outre  indéniablement un point fort. Ce couplage, déjà valorisé scientifiquement avec la détermination d’énergies d’activation pour des polymères synthétiques et biopolymères de plusieurs MDa, pourrait permettre de sonder les interactions nanoparticule-biomolécule dans les nanohybrides bioconjugués.